Negedia Digital mRNAseq
Negedia Digital mRNAseq
Innovazione nel sequenziamento dell’RNA
Negedia Digital mRNAseq è un servizio di sequenziamento di nuova generazione basato sulla generazione di librerie di cDNA a partire da RNA poliadenilato, grazie al matching mirato dell’estremità 3’ dell’mRNA.
Questo metodo parte da RNA totale, senza necessità di deplezione degli rRNA o arricchimento Poly(A), rendendolo ideale per qualsiasi livello di qualità dell’RNA, inclusi campioni degradati provenienti da tessuti clinici (plasma, siero, FFPE, tessuto fresco congelato, cellule, urina e biopsie liquide).
La preparazione delle library produce un singolo frammento per trascritto, con sequenze concentrate vicino all’estremità 3’ dei trascritti.
Questo approccio:
- Focalizza l’analisi su un sottoinsieme di RNA per una maggiore precisione.
- Riduce gli errori di sequenziamento, aumentando l’affidabilità dei risultati.
- Consente una valutazione accurata dell’espressione genica differenziale (DGE), il principale obiettivo di questo servizio.
Efficienza e Qualità
Sequenziamento Multiplexing
Grazie all’uso di index specifici per ogni libreria, il metodo supporta il sequenziamento multiplexing, permettendo di analizzare simultaneamente più campioni. Questo si traduce in:
- File FastQ
- Quality Check summary
Le librerie di cDNA vengono sequenziate dal nostro team di esperti utilizzando piattaforme avanzate come Illumina (NovaSeq/MiSeq) e MGI (MGI DNBSEQ-T7), garantendo dati affidabili e di alta qualità.
Due Versioni per specifiche esigenze
RESEARCH GRADE
(4M di reads)
Pensata per Istituti, Università e Centri di Ricerca, ideale per:
- Studi di espressione genica differenziale.
- Analisi dei pathway di Gene Ontology.
- Conferme sperimentali.
CLINICAL GRADE
(8M di reads)
Progettata per soddisfare gli standard richiesti dalla ricerca clinica, perfetta per:
- Campioni derivati da tessuti umani.
- Biopsie FFPE e altri campioni clinici.
Principali applicazioni del Negedia Digital mRNAseq
Negedia Digital mRNA-seq è un potente strumento per analizzare il profilo del trascrittoma cellulare con un’ampia gamma di applicazioni, tra cui:
01
Profilazione quantitativa dei trascritti in diversi tessuti o campioni, in varie condizioni e trattamenti
02
Scoperta di nuovi trascritti, splicing alternativo (AS) e variazioni dei trascritti.
03
Ricerca sui meccanismi di sviluppo e sulla resistenza ai farmaci tramite trascritti specifici per tessuto o analisi temporale dell’espressione genica.
04
Scoperta di biomarcatori basata su nuovi trascritti/isoforme, identificazione di SNP/InDel e analisi di geni di fusione.
05
Analisi omiche in combinazione con il trascrittoma.
06
Investigazione dei meccanismi patogenetici e dei sottotipi clinici nella diagnosi clinica.
Requisiti di qualità dei campioni
RNA Totale di alta qualità (Tessuti, Cellule, Sangue) con RIN > 7
Quantificazione
10 µl di RNA quantificato con Qubit (50 ng/µl)
Tempi di Lavorazione
25 giorni dalla ricezione del campione
Tempi di Lavorazione
25 giorni dalla ricezione del campione
Requisiti del campione
RNA deve avere un RIN ≥ 4, OD 260/280 1.9-2.1 and an OD 260/230 2.0-2.2 ; disciolto in acqua di grado molecolare elevato, priva di RNasi, DNasi e proteasi.
RNA Totale di bassa qualità (campioni degradati, FFPE, biopsie liquide) con RIN < 7
Quantificazione
10 µl di RNA quantificato con Qubit (50 ng/µl)
Tempi di Lavorazione
25 giorni dalla ricezione del campione
RNA Integrity Number (Agilent 2100)
≥ 5,8, con baseline regolare
Stoccaggio e Spedizione
-80°; spedizione in ghiaccio secco; i campioni devono essere inviati in provette da 1,5 ml con tappo a scatto. Non sono ammessi formati diversi o provette con tappo a vite.
Il Nostro flusso di lavoro
Rna QC
Library preparation
Library QC
Sequencing (SE – 100bp)
Data Analysis
25 giorni lavorativi
- Rna QC: Estrazione dell’RNA dal campione di partenza o controllo qualità dell’estratto fornito dal cliente
- Library preparatio: Controllo qualità degli estratti tramite metodo fluorimetrico (Qubit) ed elettroforesi automatizzata (Tapestation)
- Library QC: Preparazione e controllo qualità delle library
- Sequencing (SE – 100bp): Preparazione del pool e sequenziamento
- Data Analysis: Analisi bioinformatica dei dati
- Tempo di lavorazione: 25 giorni dalla ricezione del campione
Analisi Bioinformatica Avanzata
Analisi Standard:
- File FastQ
- Quality Check summary
Analisi di II livello:
- Pulizia e mapping delle reads sul genoma di riferimento
- Eliminazione dei duplicati da PCR (deduplicazione)
- Chiamata delle CNV e calcolo delle TMB e MSI quando
Analisi di III livello:
Il servizio ha come input il risultato dell’analisi di II livello e prevede:
- Classificazione secondo le linee guida ACMG o AMP attraverso la piattaforma CE-IVD Varsome Clinical.
PUBBLICAZIONE SCIENTIFICA ASSOCIATA:
Esrrb guides naive pluripotent cells through the formative transcriptional programme. Nat Cell Biol. 2023 May;25(5):643-657. doi: 10.1038/s41556-023-01131-x. PMID: 37106060; PMCID: PMC7614557.
Elena Carbognin, Valentina Carlini, Francesco Panariello, Martina Chieregato, Elena Guerzoni, Davide Benvegnù, Valentina Perrera, Cristina Malucelli, Marcella Cesana, Antonio Grimaldi, Margherita Mutarelli, Annamaria Carissimo, Eitan Tannenbaum, Hillel Kugler, Jamie A Hackett, Davide Cacchiarelli, Graziano Martello.
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